货号：SC706011

规格：50测试/盒

【产品概述】

支原体形态多样，大小介于细菌和病毒之间，可通过细菌滤器，对一般抗生素不敏感，是细胞培养过程中导致细胞污染的一种常见微生物。支原体污染细胞后，通常会引起细胞形态和功能的改变，且很难被清除。

本试剂盒针基于qPCR技术，对支原体属的保守区DNA设计引物探针，对样品中的支原体DNA进行定性检测，检测灵敏度高，特异性好，可检测的支原体包括莱氏无胆甾原体、发酵支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、肺炎支原体、鸡毒支原体、滑液支原体、螺原体等共计百余种支原体。

（图1 检测原理图）

本试剂盒以DNA探针为底物，当检品中存在核糖核酸酶时，DNA探针被降解，标记在探针上的荧光基团与淬灭基团分离（详见图1），产生荧光，该方法具有操作简便、准确性高、重复性好及高灵敏度等优点，可根据需求自由选择进行定性或定量检测。

【产品特点】

1. 操作简单，检测时间短，2个小时完成检测。

2. 适用性广，可用于各种样本类型的检测（细菌，细胞沉淀，培养液，细胞制品等）

3. 试剂盒包含内参，可对样本提取至最终上机的全过程实施监控，有效预防假阴性。

4. 检测过程闭管操作，不受环境因素影响，结果稳定，重复性高，无污染风险。

5. 灵敏度高，针对下表中的支原体检测限低至10 CFU/ml。

6. 支原体种类覆盖范围广，可检测120余种支原体。

【支原体介绍】

支原体（Mycoplasma）是一种介于细菌和病毒之间的原核细胞型微生物，它没有细胞壁，由胞外结构、单位膜和胞内结构组成，最早是在1898年由法国的Nocard及Roux自患牛肺疫的病灶中分离出来的，1967年被正式命名为支原体。

由于缺乏生物合成和代谢能力的基因，支原体必须依赖宿主细胞提供所需的营养物质，支原体的胞外结构中的荚膜和粘附结构可以帮助其粘附在细胞表面或进入细胞内部。虽然支原体广泛存在于自然环境、人和动物体内，但只有少数支原体对人有致病性。常见的人致病支原体包括肺炎支原体、溶脲脲原体、人型支原体和生殖器支原体等。巨噬细胞、lgG和IgM等宿主免疫因子可以对支原体起到一定的杀伤作用。

(图2 支原体显微形态)

【生物制品为什么要进行支原体检测】

（1）细胞培养中的支原体感染是一个普遍存在的问题：

支原体是一种广泛分布于自然环境中的微生物，其大小一般在0.2-0.5微米之间，可以透过一般滤膜，因此在细胞培养过程中，易造成支原体对细胞的感染。自1956年Robinson等首次从三株Hela细胞培养中分离出支原体以来，就不断有关于支原体污染细胞的报道出现。在细胞培养中的支原体感染，95%的污染源来自口腔支原体（M. orale），精氨酸支原体（M. arginini），发酵支原体（M. fermentans），猪鼻支原体（M. hyorhinitis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）。

（2）支原体感染的危害：

支原体感染会导致细胞内部环境的改变，影响细胞的正常生存和功能。严重的情况下，会导致细胞死亡或生物学特性的改变。此外，支原体感染会影响细胞对各类激素、药物和化学物质的反应，从而干扰实验的结果，对实验结果造成影响。

细胞是制备疫苗的主要载体之一。支原体通过引起细胞病变，竞争营养和抑制干扰素分泌等机制，产生有毒的代谢产物，干扰病毒复制，这会极大影响疫苗的产量，并可能诱导机体产生免疫抑制。

此外，在疫苗制造中，常常会将支原体污染带来的干扰误以为是病毒繁殖造成的病变效应，从而导致虚假的效力测定结果，影响病毒真正滴度的测定，使研究结果的真实性和可靠性大大存疑。

因此，针对支原体对细胞培养带来的巨大不良影响，在中国药典、欧洲药典、美国药典和日本药典中都要求，对主细胞库、工作细胞库、病毒种子批以及病毒疫苗等均需执行支原体检查。其中欧洲药典和美国药典更是要求样品首次执行支原体检查或生产流程变更时需要进行干扰性确认，以保证支原体检查结果的有效性。

【支原体的检测方法】

（1）培养法：

通过提供适合支原体生长的营养成分，培养支原体。通过对液体培养基的颜色、浊度变化，固体培养基和半流体培养基的支原体菌落形态来判断支原体的生长。

（2）荧光指示细胞法：

常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。该染料会结合到DNA 中富含A-T 的区域，由于支原体的DNA中A-T 含量占多数(55%~80%），所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体DNA，证明该细胞有支原体污染。荧光指示细胞法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺，易造成漏检。

（3）扫描电子显微镜法：

扫描电子显微镜法非常直观、准确，对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，常作为样品的最后定性检测。

（4）免疫荧光法：

免疫荧光试验利用支原体的单克隆抗体和荧光标记的二抗识别样品中的支原体抗原，通过荧光显微镜判断是否存在支原体。酶联免疫吸附试验（ELISA）同样也是使用支原体的单克隆抗体，利用抗体上的“标签”蛋白的量来判断是否存在支原体。该方法灵敏度较低，对低浓度样品容易造成漏检的情况。

（5）PCR法：

PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种体外扩增DNA的技术。PCR技术利用DNA聚合酶酶学原理，通过一系列的循环反应，将靶DNA模板扩增出数万亿份相同的DNA片段，放大检测标的，达到特异性检测的目的。PCR法检测支原体的方法最为快速、灵敏。取样量少，既可做细胞本身，也可做细胞培养液上清的检测，同时可以检测多种支原体的污染，是目前常用的检测手段，也是欧洲药典中提到的检测方法。

【应用场景】

1）抗体药、疫苗生产过程中的支原体检测

2）科研实验室细胞培养的支原体检测

【应用单位】